PRESİPİTASYON TESTLERİ

Transkript

1 SAĞLIK HİZMETLERİ MESLEK YÜKSEKOKULU TIBBİ LABORATUVAR TEKNİKLERİ TLT114-İMMÜNOLOJİK YÖNTEMLER Hafta-10 TLT114-İMMÜNOLOJİK YÖNTEMLER Öğr. Gör. Nüket ÇALIŞKAN Suda erimiş durumda bulunan antijenlerin, elektrolitli ortamda kendilerine özgü immunglobulinler (antikorlar) ile birleşmeleri sonucu önce bulanıklık sonra ince granüllü bir çökme ile sonuçlanan olaya presipitasyon denir. Çöken bulanıklığa presipitat denir. Presipitasyon reaksiyonu Çözünür haldeki antijenlerin özgül antikorlarla birleşmesi ve kafes oluşturarak çözünür olmayan presipitin (çökelek) oluşturması esasına dayanır Bu testin esası aglütinasyona benzemekle birlikte farklı olarak direk antijen yerine protein, hormon, toksin gibi çözünür (suda eriyebilen) antijenler veya antijenin çözünür fraksiyonu kullanılır. 3 4 Presipitasyon temeline dayalı çok sayıda yöntem mevcuttur Bunlar genel olarak; Sıvı ortamda (Tüpte) Jelde (immunodifüzyon) Tüpte Presipitasyon En basit presipitason yöntemidir. Genellikle kalitatif olarak antikor veya antijen varlığını saptamak için kullanılmıştır. Bu yöntemde ince serolojik tüpler veya kapiller (kılcal) tüpler kullanılır

2 Tüpte Presipitasyon Tüplerin içine konulan klinik örneğin üzerine antijen veya antikor süspansiyonu eklenir. Antijen antiserumla reaksiyona girerse iki sıvının temas yüzeyinde presipitasyon halkası oluşur. Sifiliz de hasta serumunda reagin tipi antikorların araştırıldığı Kahn testi buna örnektir. 7 8 Farklı oranlarda seyreltilen antikor antijen bulunan çözeltiye ilave edilince optimum antijen antikor konsantrasyonunun bulunduğu tüplerde reaksiyon gözlenir Jelde presipitasyon (immunodifüzyon) Jelde presipitasyonda (immünodifüzyon), presipitasyon reaksiyonları antijen ve antikor moleküllerinin birbirine doğru yayılabildiği jel veya yarı katı ortamlarda yapılır. Böyle bir ortamda birbirine doğru yayılan antijen ve antikor optimal oranda bulundukları bölgelerde karşılaştıklarında bir presipitasyon çizgisi veya bandı oluşturarak çökerler İmmünodifüzyon Yöntemleri Bu yöntemler; Antijen ve antikorun agaroz jel ortamında difüze olarak karşılaşması ve uygun oranlarda karşılaştıkları bölgede presipitin bandı oluşturması temeline dayanır İki şekilde uygulanabilir Tek yönlü difüzyon (Mancini Yöntemi) Tek yönlü difüzyon (Mancini Yöntemi) Genellikle kantitasyon amacıyla kullanılır. Radial İmmünodifüzyon da denir. Bu Yöntemde; Hedef antijen için spesifik antikor agarla karıştırılır ve bir tabaka oluşturacak şekilde bir plağa dökülür. Daha sonra agarda çukurlar açılır ve açılan çukurlara araştırılacak antijen azalan sulandırmalarla sırayla eklenir. Antijen çukurdan agarın içerisine yayılır ve bir presipat oluştuğunda çukurun çevresinde bir halka veya hale meydana gelir

3 13 14 Tek yönlü difüzyon (Mancini Yöntemi) Antikor süspansiyonu jelin içine dökülmeden önce eklendiği için yayılım sadece bir analit (antijen) için söz konusudur. Değerlendirme için saat inkübe edilir. Antijen jel içinde her yöne doğru dairesel olarak yayılacağı için halka şeklinde presipitasyon oluşur Tek yönlü difüzyon (Mancini Yöntemi) Mancini, halkanın çapının karesi ile çukurdaki antijenin konsantrasyonu arasında doğru orantının olduğunu belirlemiştir. Antijen miktarı bilinen standart serumlar kullanılarak Standart eğri oluşturulup kantitatif ölçüm yapılabilir

4 Jel içinde çukurlar açılır Birbirinden 1 cm aralıkla açılan 5 mm çaplı Hasta serumunda antijen aranıyorsa Ortadakine bilinen antiserum (antikor) kenarlardakilere ise antijen aranan hasta serumu dilüsyonları damlatılır. Hasta serumunda antikor aranıyorsa Ortadaki çukura bilinen antijen, çevredekilere ise hasta serumları damlatılır Etüvde bir gece inkübe edilir ve presipitasyon bantları değerlendirilir İnkübasyon sırasında hem antijen hem de antikor molekülleri jel içinde yayılarak (özgüllük varsa) optimum konsantrasyonlarda karşılaştıkları yerde presipitasyon bandı oluşturur. Ayrıca Coomassie mavisi gibi protein boyaları ile oluşan presipitat bandı boyanarak daha kolay görünür hale getirilebilir

5 Plağa dökülmüş agarın ortasına bir ve çevresine birkaç çukur açılır; ortadaki çukura antiserum ve çevredeki çukurlara antijenler konur. Agar üzerinde antijen ve antikor için çukurlar açılır. Çukurlara Ag ve Ab eklenir.. Antijen (Ag) Antikor (Ab) Antijen-Antikor Birleşmesi Antijenler, jel içinde her yöne doğru difuzyona uğrarlar Antikorlar, jel içinde her yöne doğru difuzyona uğrarlar Antijen ve Antikorun bir araya gelerek oluşturduğu presipitat

6 Presipitasyon bandının yoğunluğu oluşan immun komplekslerinin miktarını, bantların pozisyonu ise antijenlerin ilişkisini (benzerlikfarklılık) gösterir. Bu testte aynı seruma karşı teste tabi tutulan birçok antijenin birbirine yakınlığı da ortaya çıkarılabilir. Eğer Ab konsantrasyonu yüksekse Presipitat Ag e yakın oluşur Eğer Ag Presipitat konsantrasyonu Eğer yüksekse Ag konsantrasyonu Presipitat Ab a yakın yüksekse oluşur Her Ag-Ab birleşmesi için oluşmuş farklı presipitat 2 Antijen İlave edilmiş göz 2 Antikor İlave edilmiş göz Aynı epitopa sahip antijenler Farklı epitoplara sahip antijenler Kısmi benzerlik gösteren epitoplara sahip antijenler Çift yönlü difüzyon (Ouchterlony Yöntemi) Bilinen ve şüpheli materyalin yerleştirildiği gözler arasında presipitat oluşumu (+) reaksiyon olarak değerlendirilir. Test, serumun antikor titresinin belirlenmesi için kullanılacak ise, serumun bir seri (1/2,¼,1/8,...) sulandırması hazırlanarak test uygulanır. Antikor titresi presipitat oluşumunun görüldüğü son sulandırma basamağı olarak değerlendirilir

7 37 7