MOLEKÜLER BİYOLOJİ. Dr. ismail Bezirganoglu

Transkript

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİ Dr. ismail Bezirganoglu

2 RNA YAPISI RNA genden proteine bilginin akışında sadece bir aracı RNA, DNA replikasyonundan protein sentezine kadar temel hücre işlemlerinin geniş bir alanıyla ilgilidir. RNA yı çok amaçlı molekül yapan nedir. DNA ile karşılaştırıldığında RNA nın daha büyük yapısal bir değişkenliğe sahip olduğudur. RNA zincirleri küresel proteinlere benzer şekilde işlev gören üç boyutlu özgün yapılara katlanırlar.

3 RNA, birçok hücresel süreçte görev alır. DNA replikasyonu. mrna işlenmesi, protein sentezi proteinin hedefe yönelmesi gen ekspresyonu NÜKLEOTİD= BAZ+ŞEKER+FOSFORİK ASİT

4 RNA TıPLERı Ribozomal RNA: Ribozomun temel bileşeni Elçi RNA (mrna): Bir gene ürününü kodlayan ve sitoplazmada ribozomlara bağlanan genomik DNA dizisinin bir kopyası Taşıyıcı RNA: özgün bir amino asit ile yüklü küçük bir RNA. trna antikodonu ile mrna nın kodonu eşleşerek uygun aminoasit ribozoma iletilir. Küçük çekirdek RNA sı (sn RNA): mrna yı translasyona hazırlayan pre-mrna dan intronların çıkarılması işleminde görev alır. Küçük çekirdekçik RNA sı (sno mrna): rrna işlenmesinde rol oynar. Mikro RNA (mirna): transkripsiyon sonrası gen düzenlemesinde görev alır.

5 Protein Coding Gene Transcription exon primary transcript / pre-mrna intron Polyadenylation Splicing mrna Export Translation AAAAAAAAA Degradation Protein Folding, Modification, Transport, Complex Assembly Protein Complex Degradation

6 rna- protein etkileşimi RNA bir iskele olarak hizmet edebilir. Sinyal tanıyıcı partikülde olduğu gibi proteinler bunların üzerinde düzenli bir biçimde yapılanabilirler. Proteinler, RNA nın primer nükleotid dizisini ve sekonder ve tersiyer yapı motiflerini tanırlar. RNA-protein etkileşimleri proteinlerin katalitik aktivitelerini etkileyebilir. RNA katalitik olabilir. Ribozim olarak adlandırılan RNA molekülleri, canlı hücrelerde meydana gelen pek çok kimyasal reaksiyonu katalizleyebilir. Kısa RNA lar direk olarak gen ekspresyonunu kontrol edebilirler. RNA kalıtsal bir materyal olabilir.

7 rna nın yapısal motifleri RNA, nükleotitlerin birbirine, fosfodiester bağlarıyla eklenmesiyle oluşan bir zincir benzeri moleküldür.

8

9

10

11 Rna nın sekonder ikincil yapısı Termodinamik verilere karşılaştırılmalı dizi analizi Çözülmüş kristal yapı verileri Bilgisayar analizi yöntemiyle oldukça güvenilir doğrulukta tahmin edilebilir.

12 RNA sekonder yapısı Pseudoknot Stem Interior Loop Single-Stranded Bulge Loop Junction (Multiloop) Hairpin loop

13 RNA sarmal oluşumu tek zincir içinde oluşur. DNA da olduğu gibi RNA sarmalı da baz çiftleri arasında oluşan hidrojen bağlarıyla ve baz istifleşmeleri arasında oluşan hidrofibik etkileşimlerle kararlı hale getirilir. X ışını kristalizasyon çalışmaları RNA öncelikle her dönüşde 11 baz çifti bulunan, sağa doğru dönen A tipi çift zincir RNA sarmalları oluşturur. RNA daki riboz şekerinin 2 hidroksil grubu, B- tipi sarmal yapısının oluşumunu engeller.

14 Watson Crick baz çiftli normal A- tipi RNA sarmalları özgün ligant etkileşimler için olmayan, derin, dar büyük oluklara sahiptir. Küçük oluklar büyük oluklara nazaran daha az baz dizisine sahiptir. RNA çift sarmalındaki küçük oluklar 2 OH grubu içerirler ki bu grublar iyi hidrojen bağı yapıcıdırlar. Küçük oluklar sığ ve geniştirler buda onları ligantlar için erişilebiliryaparlar. Bu sebepden küçük olukdan RNA ya bağlanan proteinler tarafından tanınması RNA için yaygındır.

15

16 H O N H H N N N N H N N N O H Watson-Crick baz çifti Watson-Crick baz çiftine uymayan G/U (Wobble) O H N H N N H N N O N N

17 trna yapısı RNA zincirleri, globular proteinlere benzer şekilde faaliyet gösteren üç boyutlu özgün yapılara katlanır. trna kısa nükleotit zincirinden oluşur. X ışını kristograf çalışmaları trna nın hücredeki fonksiyonel şeklinin açık bir yonca yaprağı olmadığı L- şekilli üç boyutlu yapıya katlanır.

18 MODıFıYE BAZLAR Genelde taşıyıcı RNA lar 50 den fazla modifiye edilmiş baz içerir. Modifikasyonlar basit metilasyondan pürin halkasının yeniden yapılandırılmasına kadar değişebilir. Inozin(I), trna da tanımlanan ilk modifiye nükleotittir. Inozin 6. karbonda bir amino grubu yerine, bir oksijenin olması ile adenozinden farklılaşır. Nükleozit modifikasyonları yalnızca trna lara has değildir.

19 Ribozomal RNA ların olgunlaşması esnasında birçok baz modifikasyonları meydana gelir. Herhangi bir RNA da tanımlanan ilk modifiye nükleozit sık rastlanan pseudouridin dir. pseudo üridinin yan ürünüdür ve halkasının 5. karbonunun yerinde azot vardır.

20 Her trna halkasının ayrı fonksiyonu Her transfer RNA nın amino asit eklenen 3 ucu ACC nükleotit dizisine sahiptir. T halkasının trna ların ribozomlar tarafından tanınmasında rol oynar. Antikodon halkası mrna daki kodonlarla baz çiftleşmesi yapar. D halkası trna ya uygun amino asiti yükleyen, aminoaçil trna sentetazların trna yı tanımasında görev alır.

21 trna yapısı Koaksiyal raflama ile oluşan sarmal kollar Amino asit bağlama bölgesi D HALKASI T HALKASI Değişen halka Antikodon halkası

22 trna da bulunan modifiye bazların yapısı Baz çiftleşmesi yapmış kolların genellikle koaksial istifleşmelerle diğer kollarla uzun mesafeli ilişkiler kurmasıdır. Koaksial istifleşme yada sarmal istifleşme, iki farklı baz çiftleşmesi yapmış koldaki nükleotidlerin üst üste yığılması ve sürekli bir sarmal oluşturacak şekilde hizalanmalarıdır. iki sarmalın gerçekde birbirine bağlı olmaması sadece birbirine bir çizgi üzerinde sıradan istifleşmelerinden dolayı, bunlar pseudocontinous (sürekli) olarak ifade edilir. yapı iki sarmal arasındaki baz istifleşmelri ile kararlı hale getirilir.

23 Rna da yaygın tersiyer yapı motifleri RNA katlanmaları, DNA ve RNA nın çift sarmal yapılarında ilk kez görünen iki temel aygıtı kullanır. Hidrojen bağları, baz istifleşmeleri RNA nın önceden oluşmuş ikincil yapı domainleri, etkileşerek tersiyer yapıyı oluştururlar. Halka ve kabarcıklardaki baz çiftleşmesi yapmamış olduğu tahmin edilen bazlar, kural dışı baz eşleşmeleri oluşturarak uzun menzilli çeşitli etkileşimlerin oluşumunda yer alırlar. üç boyutlu yapı 2 OH grupları arasındaki etkileşim ve uzak nükleotidler arasındaki etkileşimlerle korunur. Bu uzun menzilli etkileşimler, standart watson- crick baz çiftlerinden daha az kararlıdırlar ve hafif denatüre edici şartlar altında kırılabilirler. RNA negatif yüklü olduğundan dolayı tersiyer yapı oluşumu divalent ve monovalent metal iyonlarının bağlanmasıyla veya bazik proteinlerin bağlanmasıyla yük nötralizasyonu gerektiren bir süreçtir.

24 yaygın rna katlanma motifleri Pseudoknot motifi: tek zincirli bir halka bu halkanın dışındaki komplementer bir dizi ile baz çiftleşmesi yaptığında ve koaksial istifleşme ile üç boyutlu bir yapıya katlandığında bu motif oluşur. Minor motif: büyük RNA moleküllerinin en uzun menzillietkileşimlerinde en çok bulunan motiftir. Katalitik RNA molekülünde rrna da bulunmuştur. Bu katlanma biçiminde tekzincirli adenozinler, Van der Waals etkileşimlerive hidrojen bağları aracılığıyla RNA çift sarmalının küçük olukları ile tersiyer temaslar kurarlar.

25 Tetrahalka motifi: gövde halka yapısının kararlılığını artırır. UUUU tetrahalka dizili bir stem-loop, halkadaki özel bir baz istifleşmelerinden dolayı özellikle kararlıdır.tetra halkalar sıklıkla guanin bazının 1- azot pozisyonundan, iskelet fosfatına kararlı bir hidrojen bağı olan G dönüşleri içerir. Riboz fermuar motifi: küçük oluklar arasındaki sarmal sarmal etkileşimleri kararlı hale getirir. Etkileşimler: bir sarmalın bir ribozunun 2 -OH ile ya bir pirimidin bazının 2- oksijeni yada diğer sarmalın bir pürin bazının 3- azotu arasındaki hidrojen bağlarını içerir. Kink-turn (bükülme-dönüş) motifi: Bir RNA çift sarmalına gömülü bir asimetrik internal halkadır. en göz alıcı özelliği bu yapıyla ilişkili üç nükleotitlik kabarcığın fosfodiester omurgasında keskin bir dönüştür.

26 Öpüşen firkete halkası: komplementer dizili iki firkete halkasının tek zincirli bölgeleri arasında iki firkete halkası oluşturur.

27 RNA YAYGIN TERSİYER MOTİFİ

28 rna nın katlanma kinetikleri Büyük RNA molekülleri için RNA zincirinin oluşturabileceği birçok alternatif yapı mevcuttur. Örneğin yanlış baz eşleşmeleri sebebiyle yanlış katlanma, hem sekonder hemde tersiyer yapılar için problemdir. Bu problem yalnızca moleküler biyologlar için değildir. Sadece tek veya birkaç muhtemel yapı fonksiyon sağladığından, in vivo da alternatif fonksiyonel olmayan yanlış katlanmalara karşı RNA nın kendisi korunmalıdır. Özgün RNA bağlanma proteinleri hedef RNA lar ile sıkı kompleksler oluştururlar ve RNA katlanmasına yardım edenşaperonlar olarak davranırlar. Heterojen nükleer ribonükleoprotein (hnrnp) proteinleri ailesi bunlara bir örnektir. 20 den fazla farklı proteini içeren bu grup, pre mrna nın agregasyonunu ve yanlış katlanmasını önlemeye yardımcı olur. rrna : rrna lar sadece ribosomal proteinler ile bir düzen içinde katlanarak, uygunsuz katlanıp kinetik katlanma tuzaklarına düşmekten ve buralarda kaybolmaktan kurtulurlar.

29 rna katalizinin keşfi Thomas CECH 1982 de Tetrahymena thermophila rrna genlerinin transkripsiyonu üzerine araştırmalardan sonra tetrahymena thermophila rrna sına ait tek intronunun hücre dışındada kendi splays etme aktivitesi gösterdiğini ortaya koydular. Sidney Altman Bir yıl sonra E coli ye ait ribonükleaz P (Rnaz P) ye ait RNA bileşeninin hücre dışında, protein alt birimi olmadan pretrna yı işleyebildiğini gösterdiler da araştırıcılar kimya dalında Nobel Ödülü aldılar. Bu keşif ve kimyasal evrimle ilgili yapılan diğer çalışmalar prebiyotik dünyanın RNA dünyası olduğu hipotezine götürdü. RNA dünyasının RNA larla dolu olduğunu, RNA nın hem genetik bilgiyi taşıdığı hemde proteinlerin katalitik fonksiyonlarını yaptıklarını öngörmekteydi.

30 Klonlanmış bir ribozomal RNA geninden öncül bir rrna sentezlenmesi. Başka hiçbir protein kullanılmadan, in vitro rrna ürettiler. GTP ve Mg +2 varlığında çıplak rrna kesilebiliyordu bu durum kesinlikle RNA nın kendini splaysinge uğrattığını gösteriyordu. daha sonra tetrahymena pre 26S rrna sı in vitro da transkribe edildi, fakat bu defa RNA radyoaktif olarak işaretlendi. Sonra GTP li GTP siz ortam gibi farklı koşullar altında pre-rna dan intronların splaysingini araştırdılar. Örnekler poliakrilamid jel elektroforeziyle ayrıldı ve otoradyografi olarak görüntülendi. Eğer splaysing olmuşsa kesilmiş intronların ve birbirine yapışmış eksonları içeren birçok bandın görülmesi beklendi. Sonuçlar intron splaysingi için GTP nin gerekli olduğunu intron sadece reaksiyon karışımının içinde GTP olduğu zaman, 26S rrna dan kesilip çıkartılabildi. sonuçda RNA nın katalitik aktivitesiyle kendi kendini kesmesi enzim tanımına uymaz. Bu yüzden katalitik aktiviteye sahip olan RNA moeküllerini enzimlerden ayırmak için ribozim olarak tanımlandı.

31 RNAAZ BıR RıBOZıMDıR 1971 de sidney altman E colide pre-trna nın 5 lider dizisinin işlenmesine katılan ribonükleaz P (RNAP) enzimini saflaştırmaya çalıştılar. örneklerde kontaminasyon edici RNA yı uzaklaştırmak için birçok teşebbüsden 12 yıl sonra aslında RNA nın biyolojik katalizleme özelliğine sahip olduğunu gösterdiler. RNazP RNAsı başka bir RNA molekülü üzerinde işlem yapabilen ve reaksiyon sonunda hiçbir şekilde değişmeyen gerçek bir RNA enzimidir. Ecoli RNAaz P, M1 RNA, katalitik RNA ve C5 proteininden oluşmuştur. In vitro ortamda M1 RNA, yüksek monovalent ve divalent katyon konsantrasyonunda tek başına öncül trna yı işleyebilir. In vivo ortamda ise C5 proteini M1 RNA sının katalitik aktivitesini artırmak için gereklidir.

32 RİBOZİMLER BİRÇOK KİMYASAL REAKSİYONU KATALİZLER Ribozomdaki 23S rrna, bu büyük ribozim hiçbir değişikliğe uğramadan peptid bağı oluşumunu katalizler. Ribozimler proteinlerle aynı şekilde reaksiyonları katalizlerler. Ribozimler substrata bağlanma bölgeleri oluştururlar ve reaksiyonların aktivasyon enerjisini düşürerek hızlandırırlar. birçok ribozim metalloenzimdir, aktif bölgeye divalent katyonların bağlanması, enzimin aktif formuna katlanması için kritik öneme sahiptir.

33 Büyük ve küçük ribozimler RNA az P nin RNA bileşenleri grup I ve grup II intron aileleri büyük ribozim grubundadır. Birkaç yüz nükleotidden 3000 nükleotide kadar farklılık gösterir. Anahtar özelliğinden dolayı küçük ribozimden ayrılırlar. Büyük ribozimler 3 -OH ucu üretirken küçük ribozimler 2 ve 3 siklik fosfat ve 5 - OH uçlu ürünleri üretirler. küçük ribozimler hepatit delta virüsü, varkud satellit RNA sını ve glms riboswitch ribozimini içerir nükleotit.

34 rna da oluşan genomlar RNA da oluşan genomlar: ortalama büyüklükleri nükleotid kadardır. DNA dan oluşan genomlara göre 1000 kat daha fazla mutasyona uğrarlar. Bu durumun iki temel sebebi vardır. RNA zincirlerinden RNA replikasyonu yapan protein enzimin bilindiği gibi hatay yatkın olması ve replikasyon sırasında hataları düzeltmek için herhangi bir mekanizma yoktur. Ökaryotik RNA virüsleri: çok geniş bir gruptur. Bitkileri, hayvanları içeren birçok farklı konak hücreyi enfekte eder. Çok farklı büyüklükte ve şekilde türleri vardır.

35 Zarflı zarfsız kapsidlidirler. Kapsid virüsün dış protein örtüsüdür. Zarf ise kapsülü çevreleyen lipid ve proteinden oluşmuş bir tabakadır. tipik RNA virüsleri, DNA ara ürünü oluşturmadan replike olurlar, bu özellik onları retrovirülerden ayırır. RNA genomunun tipine bağlı olarak, üç ana RNA virüsü kategorisi vardır: plus(+) zincir RNA virüsleri, minus(-) virüsleri ve çift zincirli RNA virüsleri

36 Retrovirüsler: tek zincirli RNA genomludur. Genomları reverse transkripsiyon ile DNA ara ürünü üreterek replike olur. Hayvan hücresini enfekte ettikden sonra retrovirüsler, tek zincirli RNA larını çift zincirli DNA ya çevirirler. Retrovirüs DNA ları konak hücre DNA sına entegre olur ve konak genomda kalıcı olur. Viroidler: yüksek yapılı bitkilerde enfeksiyona sebep olan subviral patojenlerdir. Viral RNA ların aksine hiçbir protein kodlamaz ve bir protein kılıfı ile korunmazlar. Viroid genomu tek, çok küçük ve nükleotitten oluşan sirküler bir RNA molekülünden oluşmaktadır. konağın kodladığı RNA polimerazı kullanarak replike olur Diğer subviral patojenler, satellit RNA lar ve virusoidler: satellit RNA lar sadece ona uygun RNA bağımlı RNA polimeraz sağlayan yardımcı bir virüsün varlığında çoğalır. büyük satellit RNA ları protein kodlayabilirler. virusoid: hiçbir proteini kodlama yeteneği olmayan çoğalmak ve kapsid oluşturmak için kesinlikle yardımcı bir virüse bağımlı olan bir RNA moekülüdür.