Prof. Dr. Turgut Ulutin DNA REPLİKASYONU (DNA EŞLEŞMESİ)

Transkript

1 Prof. Dr. Turgut Ulutin DNA REPLİKASYONU (DNA EŞLEŞMESİ)

2 DNA REPLİKASYONU Replikasyon genetik materyelin tamamen kendi benzeri yeni bir molekül oluşturma işlemidir. DNA kendini eşleyebilen yegane biyomoleküldür Replikasyon sonrası ana DNA molekülü ile tüm nukleotid dizisi tamamen aynı olan DNA molekülü ortaya çıkar. Böylece DNA da taşınan genetik bilgi her replikasyon olayı ile dölden döle aktarılır.

3

4 Ökaryotik hücrelerde DNA replikasyonu mitoz veya mayoz bölünmeye hazırlanan hücrelerin hücre siklusunun sentez fazında gerçekleşir.

5 DNA replikasyonu yarı koruyucu bir model ile açıklanır. Bu model iki zincirli sarmal DNA nın her bir ipliğinin kalıp görevi yaparak kendine yeni bir eş DNA ipliği oluşturması işlemidir. Böylece bir ana molekülden yeni oluşan her bir yavru molekül, ana DNA nın bir zincirini taşıyacaktır

6 İlk kez Meselson ve Stahl (1958) deneyleri ile DNA nın yarı koruyucu tipte bir replikasyon gerçekleştirdiğini kanıtlamişlardır.

7 DNA Replikasyonunun Temel Mekanizmaları: Hem prokaryotik hemde ökaryotik hücrelerde replikasyonun temel mekanizmaları aynıdır. Replikasyon başlangıç noktalarının tayini DNA çift ipliğinin çözünmesi Replikasyon çatalının oluşması

8 Replikasyon başlangıç noktalarının tayini: Replikasyonun gerçekleştiği genom birimine replikon denir. Her replikonda bir başlangıç ve bir bitiş noktası vardır. Prokaryotlarda çembersel DNA da bir başlangıç ve bir bitiş noktası, Ökaryotik hücrede ise çok sayıda başlangıç ve bitiş noktaları vardır.

9 Ökaryotiklerde her bir başlangıç noktası arasında kilobazlık bir mesafe bulunur. (1 kilobaz=1000 baz).

10 Başlangıç noktaları özel nukleotid dizilerinden oluşur ( A ve T den zengin tekrarlayan nukleotid dizileri) ve diziye özel olan DNA ya bağlanan proteinler = başlatıcı proteinler tarafından tanınır. Bu proteinlerin başlangıç noktalarına bağlanması ile replikasyonun ilk adımı atılır.

11 Saccoromyces cerevisia da; Replikasyon orijin noktalarında 11 nukleotidlik bir dizinin tekrarı saptanmıştır. (A veya T)TTTAT(A veya G)TTT(A veya T)

12 DNA çift ipliğinin çözünmesi Replikasyonun başlıyabilmesi için DNA çift zincirinin sarmal yapısının çözülmesi gereklidir. Çözülme işlemi başlatıcı protein kopleksinde yer alan DNA helikazlar ile gerçekleştirilir.

13

14 Replikasyon çatalının oluşması Helikaz aktivitesi ile açılan çift zincirde replikasyonun olduğu bölgeye replikasyon çatalı denir. Replikasyon olayı replikasyon çatalı nın ana DNA molekülü boyunca ilerlemesi ile gerçekleşir.

15 Replikasyon çatalında replikasyonda iş gören 4 temel yapı vardır; DNA helikaz, DNA sarmalını çözen enzim Primaz, DNA sentezinin başlıyabilmesi için gerekli olan RNA primerlerini (RNA öncül molekül) sentezleyen enzim DNA Polimerazlar, kalıp zincire komplamenter yeni DNA zincirini sentezleyen enzim Tek zincire bağlanan (SSB) proteinler, replikasyon çatalının sürekliliğini saglayan,tek DNA ipliğine bağlanarak katlanmayı önleyen proteinler

16

17

18 DNA replikasyon yönü (yeni sentezlenen zincirin yönü) 5 3 ucuna doğrudur

19 DNA replikasyon yönü (yeni sentezlenen zincirin yönü) 5 3 ucuna doğrudur DNA molekülü birbirize zıt yönde paralel iki zincir içerdiginden (biri 5 3 diğeri 3 5 ) sentezin aynı anda ve devamlı olarak ilerlemesi mümkün değildir. Bu nedenle replikasyon çatalında iki farklı sentez tipi ortaya çıkar. 1- Devamlı iplik (DNA) sentezi ( 3 5 kalıbına uygun sentez ) 2- Kesikli iplik (DNA) sentezi ( 5 3 kalıbına göre yapılan sentez)

20 Kesikli DNA zincirlerinin oluşumunu deneysel olarak gösteren Okazaki ve Ark.(1968) dan dolayı bunlara Okazaki Parçaları adı verilmiştir. (ökaryotlarda nukleotidlik parçalar) Her bir Okazaki parçasınında başlangıcında RNA primerleri bulunmaktadır.

21 Kesikli zincir Devamlı zincir

22 Replikasyon ilerledikçe RNA primerleri kesilip çıkarılır ortaya çıkan boş alanlar DNA polimerazlar tarafından kalıp DNA ya uygun olarak sentezlenir ve iki DNA ucu ligaz enzimi ile birleştirilerek bir bütün DNA ipliği oluşur. Ökaryotiklerde replikonlarda tamamlanan DNA parçalarıda yine ligaz enzimi ile birleştirilir.

23 Ökaryotik DNA polimerazlar α, β, δ, γ, ve ε. γ : mitokondriumda bulunur. mtdna replikasyonunda iş görür Diğerleri nukleusta bulunur. α: kesikli ipliğin sentezi. β: DNA tamiri. δ: devamlı ipliğin sentezi. ε: DNA tamiri.

24 Ökaryotiklerde DNA molekülünün prokaryotlardan daha büyük olması ve histon proteinleri ile kromatin yapı oluşturmaları nedeniyle farklı sentez aşamaları gözlenir.

25 Ökaryotik hücrelerde replikasyon adımları Replikasyon orijin noktalarının tayini DNA çift ipliğinin çözünmesi Replikasyon çatalının oluşması DNA polimeraz aktivitesi, sentez ve uzama Replikasyon kabarcıklarının oluşması Yeni sentezlenen DNA parçalarının birleştirilmesi Kromatin yapısının yeniden oluşumu

26 Ökaryotik DNA da replikasyon orijinleri, 20 ila 80 orijinlik gruplar şeklinde (bir replikon=replikasyon ünitesi) aktiflenirler. Tüm DNA replike oluncaya kadar S fazı boyunca yeni replikasyon orijinleri aktiflenmeye devam eder.

27 Bir replikasyon ünitesi içinde, her bir başlangıç noktası birbirinden yaklaşık nukleotidlik aralıklarla bulunur. Replikasyon orijin noktasından başlayan ve zıt yönde ilerleyen replikasyon çatalları replikasyon kabarcıkları oluşturur.

28

29 Replikasyon uç problemi Telomer-telomeraz

30 DNA replike oldukça yeni sentezlenen histonlar ile kromatin şeklinde yeniden düzenlenir. Histonlarda hücre siklusunun S fazında sentezlenir.

31 S fazı boyunca aynı kromozomun farklı bölgeleri farklı zamanlarda replike olur. Kondens kromatin (heterokromatin) geç S fazında replikasyona uğrar Aktif kromatin (ökromatin) erkan S fazında replikasyona uğrar örneğin; aktif X kromozomu S fazı boyunca, inaktif X kromozomu geç S fazında replike olur

32 DNA Repliasyonunda Topoizomerazlar Replikasyon çatalında ortaya çıkan Süperkıvrımların açılması-çözülmesinde iş görürler topoizomeraz l ;Tip I tek iplikli DNAyı keser topoizomeraz ll ;Tip II çift iplikli DNAyı keser

33 DNA TAMİRİ

34 DNA TAMİRİ DNA molekülünün yapısında meydana gelen bir değişiklik şifrelerinde değişikliğe yol açacagından hatalı protein üretilmesine çeşitli mutasyonların, farklı fenotiplerin veya hastalıkların ortaya çıkmasına neden olur.

35 DNA molekülünün içerdiği bilginin değişmeden aktarımı-devamlılığı için, replikasyon sırasında veya çevresel faktörler ile DNA da oluşan hatalar bir seri enzim tarafından düzeltilir.

36 DNA da oluşan hasarlar iki şekilde olabilir Replikasyon sırasında Çevresel etkilerle **Fiziksel (UV ışınları veya radyasyon) **Kimyasal ajanlar Her iki etkiylede ortaya çıkabilecek hatalar DNA nın bazyapısında bir değişim veya yapısında ortaya çıkan bir değişim şeklinde olabilir.

37 Hasar Tipleri: 1-Tek baz değişimleri; Depurinasyon Deaminasyon (sitozinin urasile, adeninin hipoksantine dönüşümü) Nukleotid kaybı veya kazanımı Baz analogları ile yer değişimi 2- İki baz değişimi ; Timin-timin dimeri (U.V.etkisi ile) 3- Zincir kırıkları ( İyonizan ışınlar, X-ışını, etkisi ile) 4- Zıt bağlantılar kurulması; Aynı veya zıt ipliklerdeki bazlar arasında DNA ve protein molekülleri arasında (örn:histonlar)

38

39 DNA üzerindeki hasarlı bölgeler 3 mekanizma ile düzeltilir; 1- Hatalı eşleşmenin tamiri ile 2- Baz çıkarımı ile 3- Nukleotid çıkarılması ile

40 Mekanizma Problem Hatalı eşleşmenin tamiri *Kopyalama hatası (1,2 veya 5 bazlık hatalı eşleşmeden dolayı DNA da ki hasar) Baz çıkarımı *Spontan, kimyasal veya radyasyon etkisi ile tek bazdaki hasar Nukleotid çıkarımı *Spontan, kimyasal veya radyasyon etkisi ile bir DNA segmentindeki hasar

41 DNA tamir mekanizmasında ki ( örneğin deaminasyon için) işlem dizisi sırası ile; Anormal bazın tanınması ; N-glikozilaz enzimi ile Apurinik veya aprimidinik endonukleaz ile kesim (hatalı bölgenin kesilip atılması) DNA polimeraz beta ile DNA sentezi ( boşluğun doldurulması) Ligaz ile iki DNA ucunun birleştirilmesi

42

43

44 DNA tamir sendromları DNA tamir mekanizmasındaki yetersizlik veya eksiklikler insanda önemli kalıtsal hastalıklara yol açar. Tamir mekanizmasına katılan enzim veya proteinlerin gen defektlerine bağlı olarak insanda otosomal ressesif kalıtım gösteren DNA tamir sendromları vardır.

45 Xeroderma pigmentosum (XP) ; DNA nın UV ışığa aşırı hasasiyetine bağlı olarak gelişen bir genetik temelli deri hastalığıdır. Kişilerde güneşe aşırı hassasiyet, UV den etkilenen bölgelerde çeşitli deri kanserlerinin oluşumuna yatkınlık gözlenir. Moleküler mekanizmasında,uv ile hasarlanan DNA nın onarılamaması, bozuk eksizyon (kesipçıkarma) enzimi veya bozuk helikaz enzimi olduğu tespit edilmiştir.

46 DNA tamir genleri ilk kez mayalarda radyasyona hassasiyet genleri olarak bulunmuş ve RAD genleri olarak isimlendirilmiştir. İnsanda da DNA tamir genleri olarak bilinen ve hasarlandığı zaman yukarıda verilen sendromlara neden olan genlerden bazıları ve ürünleri şunlardır, Gen Ürün XPA Hasarı tanıma enzimi XPB Helikaz XPC DNA ya bağlanan proteinler XPD Helikaz XPF 5 nukleaz XPG 3 nukleaz

47 Ataxia telangiectasia (AT) ; İyonizan radyasyon (X - ışınları) etisi ile ortaya çıkan DNA hasarının onarılamaması Kas kontrol kaybı,immun sistem bozuklukları, kansere yatkınlık (lösemi ve lenfoma gibi). Moleküler temelinde anormal DNA sentezi yatar.

48 Fanconi anemia ; UV ve bazı kimyasallar nedeniyle DNA hasarının meydana gelmesi ve eksizyon enzim eksikliği nedeniyle tamir olmaması hastalığın altında yatan nedendir. Azalmış kan hücreleri, kalp ve böbrek malformasyonları, deride pigmentleşme, kanser ve kromozom anomalileri klinik bulgularıdır.

49 MUTASYON

50 MUTASYON Mutasyon; DNA dizilerinde ( genotipte ), meydana gelen kalıtsal değişiklerdir. Mutasyon; gen ürünü olan protein yapısında değişikliğe yada o proteinin hiç yapılmamasına neden olabilir. Mutasyon ; hücre veya organizmada kısmi bozukluklara neden olabilir.

51 Mutasyona uğramış organizma yada hücreye MUTANT denir görünüş, fizyolojik işlemler veya davranışlardaki farklılıklar ile yabani=mutasyona uğramamış organizmalardan ayırt edilirler

52 Mutasyonlar 1. Spontan (kendiliğinden ) 2. İndüklenebilir (yapay- yönlendirilmiş)

53 Spontan mutasyonlar DNA replikasyonu sırasında düşük oranlarda purin veya pirimidin bazlarında meydana gelen değişiklerden kaynaklanır Çoğu DNA tamir mekanizmaları ile kaldırılır. Tamir olamayanlar Mutasyonlar olarak ortaya çıkar. Mutasyon DNA tamir mekanizmasındaki yetmezlik sonucudur.

54 İndüklenebilir mutasyonlar Hücre veya organizmanın çevresel koşullardan etkilenmesi sonucu DNA da ortaya çıkan yapısal değişiklerdir Mutajenler Fiziksel (U.V ışınlar, İyonizan ışınlar, Manyetik alan, Sıcaklık) Kimyasal (kanserojen ajanlar örn; aflotoksin-b1, nitröz asidi, Alkilleyici ajanlar)

55 Mutasyon Tipleri 1- Gen Mutasyonları 2- Kromozom Mutasyonları ( yapı ve sayı değişimi ) (büyük ölçekli Mutasyonlar)

56 Mutasyon Tipleri 1. Gen Mutasyonları Tek baz değişimleri ** Yanlış eşleşme ** Anlamsız mutasyon ** Sessiz mutasyon Kırpılma-yeri mutasyonları 2. Kromozom Yapı-Sayı Değişikliği Mutasyonları ** Nukleotid Katılım veya Çıkarım mutasyonları ** Duplikasyonlar ** Translokasyonlar

57

58 Tek-Baz değişimleri ( Nokta Mutasyonları) Bir bazın, bir diğeri yer değiştirmesidir Eğer bir purin ( A veya G) veya bir pirimidin (C veya T) bir diğeri ile yer değiştirirse buna transisyon adı verilir. Eğer bir purin, bir pirimidin ile yer değiştirirse veya tersi olursa buna transversiyon adı verilir GAG Glutamik asit GTG Valin

59 Örneğin Orak hücre anemisi 17. Nukleotidte A yerine T geldiğinde hemoglobinnin beta zincirindeki gende GAG ( glutamik asit) ile GTG (valine). yer değiştirir

60 Tek-Baz değişimleri ( Nokta Mutasyonları) Bazı nukleotid değişimleri anlamsız kodon (sonlandırıcı=stop kodonlar) ortaya çıkmasına neden olur TAA, TAG, veya TGA Bu kodonlar mrna nın o noktalarda translasyonu durdurmasına neden olur ve kısa proteinler (disfonksiyonel proteinler) oluşur.

61 Tek-Baz değişimleri ( Nokta Mutasyonları) Örn; Kistik fibroziste Nukleotid te oluşan baz değişimi CAG Glutamin TAG sonlandırıcı kodon oluşan protein 1480 amino asid (a.a) yerine 493 a.a lik bir proteindir ve fonksiyonsuzdur.

62 Sessiz mutasyon Bazı a.a ler birden fazla kodona sahiptirler örn:serin TCT TCA TCC TCG Üçüncü baz değişiminde yine serin a.a. i polipeptitde yer alır.

63 Kırpılma-yeri mutasyonları

64 İnsersiyon - Delesyon Bir genin DNA sından ekstra bir baz çiftinin veya nukleotid dizisinin eklenmesi İnsersiyon - çikarılması ise Delesyon adını alır. Sayı değişikliği birden - binlerce nukleotide kadar değişir.

65 İnsersiyon ve delesyon translasyon sırasında codon kaymasına ve farklı okumaya neden olan Çerçeve Kayması na neden olur.

66 Çerçeve kayması bazen yeni bir sonlandırıcı (=stop) kodon oluşmasına neden olarak yeni bir anlamsız mutasyon oluşur ve fonksiyonel olmayan kısa proteinler üretilir.

67 Frajil -X Sendromu İnsanda X kromozomunun bir lokusunda CGG tripleti çok sayılarda tekrarlanır (CGGCGGCGGCGG,,,,,,,,) yaklaşık 4000 den fazla Bu olay X kromozomunu kırılgan yapar ve mental gerilik ile seyreden ciddi genetik hastalık ortaya çıkar.

68 Kromzom mutasyonları; Burkitt lenfoma translokasyon Philadelphia kromozomu

69 Somatik Germ hücre Mutasyonları Somatik mutasyonlar Somatik hücrelerde (örn;kemik iliği, karaciğer vs) ortaya çıkan mutasyonlar * hücre hasarına, * kanser hücresi oluşumuna, * hücre ölümüne neden olabilir Somatik mutasyonlar oluştuğu hücre ile sınırlıdır ve döle geçiş yapmaz Germ hücre mutasyonları Gametlerde ortaya çıkan mutasyonlardır ve dölden döle geçiş gösterir