Epigenetik modifikasyonlarla çalışma yöntemleri.

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Epigenetik modifikasyonlarla çalışma yöntemleri."

Elmas Saçan
6 yıl önce
İzleme sayısı:

1 Epigenetik modifikasyonlarla çalışma yöntemleri

2 Epigenetik modifikasyonlarla çalışma yöntemleri DNA metilasyonu bisülfit dizileme TTCGCCGACTAA TTCGCCGAuTAA Histon modifikasyonu kromatin immunopresipitasyonu (ChIP) DNA adenosin metilasyon tayini (DamID) sirna üretimi derin dizileme

3 Bisülfit uygulaması sitosin ve metil sitosini ayırır N NH2 N NH2 CH3 Metilsitosin TTCGCCGACTAA O N ~ sitosin O N ~ 5-metilsitosin Uygulama yok Bisülfit uygulaması Bisülfit uygulaması TTCGCCGACTAA TTCGCCGAuTAA O N O N ~ urasil O N NH2 N ~ 5-metilsitosin CH3 DNA ya bisülfit uygulandığında, metillenmemiş sitosinler urasile dönüşür. Metil sitosin etkilenmez.

örneklerde farklıdırlar. Buna karşın metil-c ise ayni örnekte C olarak okunur.

4 Bisülfit uygulaması sitosin ve metil sitosini ayırır Metilsitosin TTCGCCGACTAA Bisülfit uygulamasından sonra C ler T olarak okunur ve uygulamalı ve uygulamasız örneklerde farklıdırlar. Buna karşın metil-c ise ayni örnekte C olarak okunur. Uygulama yok TTCGCCGACTAA TTCGCCGACTAA Bisülfit uygulaması TTCGCCGAuTAA TTCGCCGATTAA

5 Kromatin immünopresipitasyonu(chip) Modifiye histon (örn.. H3K4me) DNA nın histona çapraz bağlanışı

6 Kromatin immünopresipitasyonu (ChiP) DNA nın histona çapraz bağlanışı DNA yı ufak parçalara ayır ve modifiye histona özgün antikor ekle, affinite saflaştırması ile antikor ve bağlı histon kompleksini ayır.

7 Kromatin immünopresipitasyonu (ChiP) DNA nın histona çapraz bağlanışı Çapraz bağlantıyı yok et, DNA yı saflaştır ve PCR, dizileme veya mikroarray ile analiz yap. DNA yı ufak parçalara ayır ve modifiye histona özgün antikor ekle, affinite saflaştırması ile antikor ve bağlı histon kompleksini ayır.

8 DNA adenin metilasyonu ID (DamID) Bir füsyon proteini Dam ve ilgilenilen bir protein Dam metilaz (E. Coli den) İlgilenilen protein (örn. LHP1) Dam bir adenine metiltransferaz ve GATC dizi özgüllüğü vardır. Füsyon proteini kromatinin seçilen bölgesine (örn. H3K27me3) bağlanır ve GATC bölgesi yakınındaki metiller. adeninleri

endonukleaz sindirimi (metilasyon duyarlı) GATC Bağlanma bölgesi

9 Metilasyon metilasyona duyarlı enzimlerle tanımlanabilir. Bağlanma bölgesi yakınında olamayan yer GATC DpnII restriksiyon endonukleaz sindirimi (metilasyon duyarlı) GATC Bağlanma bölgesi yakınındaki yer GATC GATC PCR amplifikasyonu GATC GATC ÜRÜN YOK ÜRÜN OLUŞUR

Derin dizileme gelecek generasyon DNA dizileme yöntemleri Klasik DNA dizileme Bir seferde bir molekül dizilenir. Gelecek generasyon DNA dizileme one milyonlarca molekül bir seferde dizilenir.

10 Derin dizileme gelecek generasyon DNA dizileme yöntemleri Klasik DNA dizileme Bir seferde bir molekül dizilenir. Gelecek generasyon DNA dizileme one milyonlarca molekül bir seferde dizilenir. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE copyright Margulies, M., et al., (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437:

11 Klasik DNA dizileme Base G A Dört standart dntps + T C Fluorescently-labeled ddntps + + Primer Template strand DNA Polimeraz 5 CCGGTTAA 3 GGCCAATTAAGCGGCTGATT

Klasik DNA dizileme Primer Template strand 5 CCGGTTAA 3 GGCCAATTAAGCGGCTGATT Primer Template strand 5 CCGGTTAAT 3 GGCCAATTAAGCGGCTGATT Primer Template strand

12 Klasik DNA dizileme Primer Template strand 5 CCGGTTAA 3 GGCCAATTAAGCGGCTGATT Primer Template strand 5 CCGGTTAAT 3 GGCCAATTAAGCGGCTGATT Primer Template strand 5 CCGGTTAATTC 3 GGCCAATTAAGCGGCTGATTT DNA polimeraz etiketlenmemiş dntplere veya etiketli ddnptlere bağlanır, sonuçta etiketli farklı boyutta moleküller oluşur.

13 Klasik DNA dizileme DNA molekülleri elektroforez ile ayrılır. Detektör Laser TTCGCCGACTAA

Gelecek generasyon dizileme yöntemleri: Pyrodizileme Primer Template strand 5 CCGGTTAA 3 GGCCAATTAAGCGGCTGATT T Pyrodizilemede etiketli nuklotidler

14 Gelecek generasyon dizileme yöntemleri: Pyrodizileme Primer Template strand 5 CCGGTTAA 3 GGCCAATTAAGCGGCTGATT T Pyrodizilemede etiketli nuklotidler ve ddntpler kullanılmaz. Pyrophosphate nukleotid eklenmesi ile açığa çıkar ve substrat... Primer Template strand 5 CCGGTTAAT 3 GGCCAATTAAGCGGCTGATT

15 Pyrodizileme - Kimya PYROPOSFAT + Adenosin 5 posfat sulfat ATP Sulfurilaz...veya ATP sufurilaz, ATP Oluşturur... ATP

16 Pyrodizileme - Kimya ATP luciferaz tarafından ışık uyarımını tetikler. PYROFOSFAT + Adenosin 5 fosfat sulfat ATP Sulfurilaz ATP LUCIFERAEZ + Işık oluşumu Luciferin

17 Pyrodizileme - Kimya T T

18 Pyrodizileme data değerlendirilmesi 5 CCGGTTAA 3 GGCCAATTGAGC... dttp Reaksiyon yok BİRİNCİ DÖNGÜ dntps eklenir ve eklenme ışık oluşumu ile izlenir. 5 CCGGTTAAT 3 GGCCAATTACGA... dttp PPi ATP

19 Pyrosequencing data değerlendirilmesi 5 CCGGTTAAC 3 GGCCAATTGAGC... dctp İKİNCİ DÖNGÜ PPi ATP dntps eklenir ve eklenme ışık oluşumu ile izlenir. 5 CCGGTTAAT 3 GGCCAATTACGA... dctp No Reaction

20 Pyrodizileme data değerlendirilmesi dttp dgtp dctp datp dttp dgtp dctp datp TIME AG AC Her bir noktadan ışık oluşumu (flowgram) DNA dizilerini açıklar.

21 A pyrodizileme flowgram Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE copyright Margulies, M., et al., (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437:

Diğer gelecek generasyon dizileme yöntemleri high throughput, ve massive parallelism yöntemler işgücünü ve kimyasal kullanımını azaltmaktadırlar.

22 Diğer gelecek generasyon dizileme yöntemleri high throughput, ve massive parallelism yöntemler işgücünü ve kimyasal kullanımını azaltmaktadırlar. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE Biotechnology Copyright Shendure, J., and Ji, H. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotech. 26:

2007 Genome-Wide Profiling and Analysis of Arabidopsis sirnas. PLoS Biol 5(3): e57. Zhang, X., Clarenz, O., Cokus, S.

23 Gelecek generasyon dizileme ile, epigenetik modifikasyonlar da tüm genom düzeyinde incelenebirler: EPİGENOMİKS GREEN = H3K27me3 PURPLE = methylcytosine Abundance of sirnas Kasschau KD, Fahlgren N, Chapman EJ, Sullivan CM, Cumbie JS, et al Genome-Wide Profiling and Analysis of Arabidopsis sirnas. PLoS Biol 5(3): e57. Zhang, X., Clarenz, O., Cokus, S., Bernatavichute, Y.V., Pellegrini, M., Goodrich, J., Jacobsen, S.E. (2007) Whole-genome analysis of histone H3 lysine 27 trimethylation in Arabidopsis. PLoS Biol. 5: e129.

Benzer belgeler

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP)

Deney: M 1 POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP) a) PCR yöntemi uygulaması b) RPLF sonuçları değerlendirilmesi I. Araç ve Gereç dntp (deoksi Nükleotid